Сюжет игры начинается с того, что Дезмонд очнулся в первичной тестовой программе Анимуса, где уже находится 16-й (как выяснилось, его имя — Клэй Качмарек). 16-й объясняет ему, что Анимус пытается найти Дезмонда и удалить, как вредоносный вирус, а Клэй изо всех сил пытается предотвратить это. Дезмонд должен будет пережить последние воспоминания своих предков, и столкнуться со своим собственным прошлым, и если это ему удастся, то произойдет синхронексус и он сможет выйти из комы.

1511 год. 52-летний мастер-ассасин Эцио Аудиторе да Фиренце отправляется на Восток, на родину великого ассасина Альтаира ибн Ла-Ахада, где ищет следы утерянной библиотеки Ордена ассасинов. Это опасное путешествие обещает быть полным открытий и откровений. По прибытии в заснеженный Масиаф Эцио обнаруживает, что город оккупирован византийскими тамплиерами. Проиграв битву с ними, Эцио чудом избегает смерти в плену от руки жестокого Леандра, капитана тамплиеров. Пробравшись в катакомбы, Эцио обнаруживает, что для доступа к библиотеке Альтаира нужны пять печатей-ключей. Одна из печатей уже попала в руки тамплиеров, и Эцио предстоит отнять у Леандра дневник Никколо Поло (отца Марко Поло), в котором дана информация об остальных. Выйдя из деревни, Эцио в повозке преследует Леандра, но византийские бомбисты на бегу уничтожают повозку и тяжело ранят Эцио. Эта погоня привела его в поселение в горах, которое находится под контролем византийцев. Пробравшись в цитадель, ассасин убивает стражу и самого Леандра. Перед смертью тамплиер отдает дневник Эцио, сказав, что книга ему уже не поможет и один ключ уже найден византийцами. Он также говорит, что тамплиерам не нужны книги Альтаира, а нужны лишь указания, которые направят их к некому Великому Храму.